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激光共聚焦顯微鏡中的“點(diǎn)掃描”與“面掃描”

來源：時(shí)間：2025-02-20 09:51:03 瀏覽：839次

激光共聚焦顯微鏡中的“點(diǎn)掃描”與“面掃描”

激光共聚焦顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM）作為一種高性能的光學(xué)顯微成像技術(shù)，以其高分辨率、三維成像能力和非侵入性特點(diǎn)，在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用。在CLSM成像技術(shù)中，“點(diǎn)掃描”與“面掃描”是兩種不同的掃描方式，它們各自具有獨(dú)特的工作原理、成像特點(diǎn)和應(yīng)用場(chǎng)景。

一、點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡

1. 工作原理

點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡使用激光作為光源，通過一個(gè)微小的光束掃描樣品。樣品中的熒光分子在激光激發(fā)下發(fā)光，這些熒光信號(hào)通過一個(gè)針孔被檢測(cè)，只有來自焦平面的熒光信號(hào)能夠通過針孔到達(dá)探測(cè)器。這樣可以有效排除焦平面以外的信號(hào)，提高圖像的分辨率和對(duì)比度。

具體來說，點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡利用激光束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源，對(duì)標(biāo)本內(nèi)焦平面的每一點(diǎn)進(jìn)行掃描。標(biāo)本上的被照射點(diǎn)，在探測(cè)針孔處成像，由探測(cè)針孔后的光電倍增管（PMT）或冷電耦器件（cCCD）逐點(diǎn)或逐線接收，迅速在計(jì)算機(jī)監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖像。在此過程中，照明針孔與探測(cè)針孔相對(duì)于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在探測(cè)針孔處成像，從而實(shí)現(xiàn)了共聚焦成像。

2. 成像特點(diǎn)

高分辨率：由于點(diǎn)掃描方式可以精確控制激光束的位置和大小，因此能夠?qū)崿F(xiàn)高分辨率的成像。

光學(xué)切片能力：點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡能夠排除焦平面以外的信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的光學(xué)切片，獲取特定深度下的圖像。

三維成像：通過逐層掃描樣品并疊加圖像，可以構(gòu)建出樣品的三維結(jié)構(gòu)。

3. 應(yīng)用場(chǎng)景

點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡因其高分辨率和良好的光學(xué)切片能力而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)和組織學(xué)研究。它能夠提供高質(zhì)量的三維圖像，適用于固定細(xì)胞和組織的詳細(xì)結(jié)構(gòu)分析。然而，點(diǎn)掃描共聚焦的成像速度相對(duì)較慢，光毒性較強(qiáng)，可能不適合長(zhǎng)期或高速的活細(xì)胞成像，以及大組織樣本的數(shù)據(jù)采集。

二、面掃描共聚焦顯微鏡（轉(zhuǎn)盤共聚焦為例）

雖然嚴(yán)格意義上的“面掃描”共聚焦顯微鏡并不常見，但轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡（Spinning Disk Confocal Microscopy）在一定程度上實(shí)現(xiàn)了類似面掃描的效果，它通過快速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)盤和多個(gè)針孔同時(shí)工作，提高了成像速度。

1. 工作原理

轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡使用一個(gè)帶有微透鏡陣列的轉(zhuǎn)盤來增加照明效率和采樣速率。轉(zhuǎn)盤上的每個(gè)微透鏡都對(duì)應(yīng)一個(gè)針孔，當(dāng)轉(zhuǎn)盤旋轉(zhuǎn)時(shí)，激光束通過微透鏡陣列被分散到樣品的多個(gè)點(diǎn)，同時(shí)多個(gè)針孔同時(shí)工作收集熒光信號(hào)。這樣，相比于點(diǎn)掃描方式，轉(zhuǎn)盤共聚焦可以提供更快的成像速度和較低的光毒性。

2. 成像特點(diǎn)

高速成像：轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡的成像速度遠(yuǎn)快于點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡，適合動(dòng)態(tài)過程的實(shí)時(shí)觀察。

低光毒性：由于成像速度快，樣品受到的激光照射時(shí)間減少，從而降低了光毒性。

視野和靈敏度：轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡還能提供較好的視野和較高的靈敏度，適用于弱信號(hào)的檢測(cè)。

3. 應(yīng)用場(chǎng)景

轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡非常適合動(dòng)態(tài)過程的實(shí)時(shí)觀察，以及高分辨率下對(duì)切片進(jìn)行快速觀察及數(shù)據(jù)采集。此外，它還能在弱信號(hào)檢測(cè)方面發(fā)揮優(yōu)勢(shì)。然而，與點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡相比，轉(zhuǎn)盤共聚焦的分辨率略遜一籌。

三、比較

1. 分辨率

點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡通常具有更高的分辨率，因?yàn)樗軌蚓_控制激光束的位置和大小，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的高精度掃描。而轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡雖然成像速度快，但在分辨率上可能稍遜于點(diǎn)掃描方式。

2. 成像速度

轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡的成像速度遠(yuǎn)快于點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡。這是因?yàn)檗D(zhuǎn)盤共聚焦通過快速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)盤和多個(gè)針孔同時(shí)工作，提高了采樣速率和照明效率。因此，轉(zhuǎn)盤共聚焦更適合動(dòng)態(tài)過程的實(shí)時(shí)觀察和快速數(shù)據(jù)采集。

3. 光毒性

由于成像速度快，轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡對(duì)樣品的光毒性較低。而點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡由于需要逐點(diǎn)掃描樣品，因此可能對(duì)樣品造成較大的光損傷。然而，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡也在努力降低光毒性，以適應(yīng)更廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景。

4. 應(yīng)用領(lǐng)域

點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡因其高分辨率和光學(xué)切片能力而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、組織學(xué)研究以及生物醫(yī)學(xué)研究中的固定細(xì)胞和組織的詳細(xì)結(jié)構(gòu)分析。而轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡則更適合動(dòng)態(tài)過程的實(shí)時(shí)觀察、弱信號(hào)檢測(cè)以及高分辨率下對(duì)切片進(jìn)行快速觀察及數(shù)據(jù)采集等領(lǐng)域。

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