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圓二色光譜儀基礎(chǔ)知識，不會操作？簡單照做就搞定！

來源：時間：2022-12-01 16:50:33 瀏覽：8928次

1.引言

光學(xué)活性物質(zhì)對組成平面偏振光的左旋和右旋圓偏振光的吸收系數(shù)（ε）是不相等的，εL≠εR，這會使左、右圓偏振光透過后變成橢圓偏振光，這種現(xiàn)象稱為圓二色性（Circular dichroism, 縮寫為CD）[1]。

根據(jù)圓二色光譜法的原理和測試要求設(shè)計制成的儀器稱為圓二色光譜儀，該儀器廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)構(gòu)象、酶動力學(xué)、配位化合物、手性化合物等的科學(xué)研究。

利用圓二色光譜儀進(jìn)行分析時，所得結(jié)果常以圓二色光譜顯示。圓二色光譜中的橫坐標(biāo)是平面偏振光的波長λ，縱坐標(biāo)為吸收系數(shù)之差（Δε=εL-εR）。由于εL≠εR，透射光不再是平面偏振光，而是橢圓偏振光，摩爾橢圓度[θ]與Δε的關(guān)系為：[θ]=3300Δε，因此圓二色光譜也可以摩爾橢圓度為縱坐標(biāo)，以波長為橫坐標(biāo)作圖。

2.圓二色光譜儀的原理與結(jié)構(gòu)

2.1 圓二色光譜儀的原理

光是橫電磁波，是一種在各個方向上振動的射線。其電場矢量與磁場矢量相互垂直，且與光波傳播方向垂直。由于產(chǎn)生感光作用的主要是電場矢量，一般就將電場矢量作為光波的振動矢量。光波電場矢量與傳播方向所組成的平面稱為光波的振動面。若此振動面不隨時間變化，這束光就稱為平面偏振光，其振動面即稱為偏振面，如圖1所示。

平面偏振光可分解為振幅、頻率相同，旋轉(zhuǎn)方向相反的兩圓偏振光，如圖2所示，圓偏振光的振幅保持不變，而方向周期性變化，電場矢量繞傳播方向螺旋前進(jìn)。其中電矢量以順時針方向旋轉(zhuǎn)的稱為右旋圓偏振光，如圖3所示，其中以逆時針方向旋轉(zhuǎn)的稱為左旋圓偏振光，如圖4所示。兩束振幅、頻率相同，旋轉(zhuǎn)方向相反的偏振光也可以合成為一束平面偏振光。如果兩束偏振光的振幅不相同，則合成的將是一束橢圓偏振光。

此外，要想好好了解圓二色光譜儀，還需懂得何為光學(xué)活性物質(zhì)，即能使射入物質(zhì)的平面偏振光的偏振面旋轉(zhuǎn)的物質(zhì)稱為旋光性物質(zhì)或光學(xué)活性物質(zhì)，具有手性結(jié)構(gòu)的分子才具有光學(xué)活性。

2.2 圓二色光譜儀的結(jié)構(gòu)

圓二色光譜儀主要由氙燈、單色器、光電調(diào)節(jié)器、樣品池以及光電倍增管檢測器組成，其結(jié)構(gòu)簡示圖如圖5所示。

該儀器采用氙燈作光源，光電倍增管作檢測器，波長范圍165～850 nm，檢測范圍為±3000 m°，具有波長可調(diào)、光通量大、靈敏度高、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確和信噪比高等優(yōu)勢。其中旋光色散附件包含一個可旋轉(zhuǎn)的線偏振分析棱鏡，其以45°角處在樣品和檢測器之間，來切換垂直和水平光。在圓二色光譜儀的光路上裝配旋光色散附件即可進(jìn)行旋光的測定，從而在手性藥物研究中不需使用兩種儀器[2] 。

雖然圓二色光譜儀的組成部件簡單，但是在使用過程中也有需要注意的地方，以下我們以AVIV 410型圓二色光譜儀為例，簡單介紹一些儀器開機(jī)調(diào)試、開機(jī)參數(shù)設(shè)置以及樣品池的選擇三個方面的內(nèi)容：

（1）儀器開機(jī)調(diào)試：

圓二色光譜儀屬于高靈敏度的光譜類儀器，儀器的自身狀態(tài)和外部測試條件都會直接影響到數(shù)據(jù)的質(zhì)量，因而在實(shí)際的使用過程中，由于每次儀器的狀態(tài)都不一樣，包括氮?dú)鈿饬?，氙燈的穩(wěn)定性，以及測試條件如溫度、相對濕度也在不斷地變化，這些因素都會影響測試的靈敏度和準(zhǔn)確度。

a）在開機(jī)前需要把氮?dú)饬髁空{(diào)節(jié)在0.15～0.2 MPa之間通氮?dú)?0 min左右，先驅(qū)除儀器光路中的氧氣及水汽，特別是氙燈產(chǎn)生的臭氧，它會對紫外光吸收產(chǎn)生干擾；

b）然后打開氙燈電源，等待“l(fā)amp ready”燈亮后，按下“ignite lamp”，點(diǎn)亮氙燈；

c）再打開“CPU/INST PWR”按鈕，打開電腦，打開控溫循環(huán)水、打開軟件進(jìn)行參數(shù)設(shè)置。

（2）開機(jī)參數(shù)設(shè)置：

a）波長范圍設(shè)置：測試的波長范圍在充分包括樣品信號的情況下盡可能地遠(yuǎn)離真空紫外區(qū)，以減小環(huán)境和溶劑紫外吸收的影響；

b）譜帶寬度選擇：對于正常測量最佳譜帶寬度是1～2 nm。需要高分辨率測量時，需用較窄的譜帶寬度，此時光電倍增管的電壓較高，譜的信噪比差。而對于樣品的吸光度很高但CD信號很弱時，一方面要盡量保證測定CD峰所需要的足夠濃度，另一方面要設(shè)置較寬的譜帶，以犧牲分辨率而得到較好的信號。另外，在固體CD光譜測試時也需要較大的譜帶寬度（一般要求> 2 nm）；

c）掃描速度：測試時根據(jù)需要選擇合適的掃描速度，一般選擇100 nm/min，在進(jìn)行粗掃描決定CD信號位置時可選擇比較快的掃描速度。

（3）樣品池的選擇：

AVIV 410型圓二色光譜儀對液體樣品測試時使用兩面透光的石英比色皿即可，常用的比色皿光程分為1.0 cm、5.0 mm、2.0mm、1.0 mm、0.5 mm、 0.2 mm 、 0.1 mm等規(guī)格。圓二色光譜本質(zhì)上仍然是吸收光譜，因此朗伯比爾定律也適用于圓二色光譜。在一定濃度范圍內(nèi)，圓二色信號的強(qiáng)度和樣品的濃度及光程成正比。一般圓二色信號較好，溶劑影響小的情況下選用1.0 cm光程的比色皿即可。但有些樣品，信號較弱，就需要提高樣品的濃度，濃度太大時，使用光程大的比色皿，電壓會超出檢測范圍，這時可以選用光程小的比色皿，可以有效地減少溶劑的吸收及濃度的逆效應(yīng)，達(dá)到提高檢測信號的目的。檢測固體樣品一般用石英片即可，把樣品均勻地涂在石英片上或夾在兩片石英片中間固定后置于光路檢測[3]。

3.圓二色光譜儀的圖譜及樣品要求

3.1 圓二色光譜儀的圖譜

我們在引言部分提到了圓二色光譜儀的圖譜，即圓二色譜。由于吸收系數(shù)之差（ Δε ）有正值和負(fù)值之分，所以圓二色譜也有呈峰的正性圓二色譜和呈谷的負(fù)性圓二色譜。在紫外可見光區(qū)域測定圓二色譜與旋光譜，其目的是推斷有機(jī)化合物的構(gòu)型和構(gòu)象。

如圖6所示的圓二色譜，其中包含的三種曲線所代表的含義如下所示：

a）當(dāng)光學(xué)活性化合物對光沒有特征吸收時，在譜圖中僅為一條近似水平的直線；

b）當(dāng)光學(xué)活性化合物對光存在特征吸收時，通常有兩種情況：當(dāng)εL大于εR時，得到一個正性的圓二色光譜曲線；當(dāng)εL小于εR時，得到一個負(fù)性的圓二色光譜曲線。

3.2 獲取理想的圖譜

在用圓二色光譜儀對溶液或固體樣品進(jìn)行測試時，我們都想獲取理想的CD譜圖，為了實(shí)現(xiàn)這個目的，我們應(yīng)該注意以下幾個方面：

a）手性樣品符合CD光譜測試的條件（在給定波長范圍內(nèi)有較強(qiáng)的CD信號和合適的吸收值）。必須事先測定手性樣品的UV-Vis吸收光譜（溶液或固體漫反射），預(yù)測CD譜峰的可能位置和選擇合適的制樣濃度（對于溶液吸收光譜，A ≈ 1）；

b）提供高對映純度的手性樣品；

c）根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇測定方式（溶液、固體、單晶或熒光CD）；

d）對溶液樣品應(yīng)選用合適的溶劑、濃度和光程（與測定UV-Vis光譜類似）。對于在紫外區(qū)測試的樣品建議選用較小的光程（≤0.5 cm）和截止波長足夠低的溶劑，最好為高純水或醇類溶劑；

e）對固體樣品的壓片法測試，應(yīng)視樣品的不同選用合適百分比濃度及合適的稀釋劑（KBr、KCl或CsI等）研磨壓片后進(jìn)行透射掃描；

f）選擇適當(dāng)?shù)臏y定參數(shù)（波長范圍、掃描速度、靈敏度和狹縫等）；

g）對于同一個樣品，在可能的條件下，建議同時做其溶液和固體CD光譜加以比較；

h）如果可能，最好同時做一對對映體的CD光譜，以檢查其CD信號的真?zhèn)魏驮诙康臈l件下互相印證其對映純度。

3.3 圓二色光譜儀的樣品要求

a）樣品必須保持一定的純度，不含光吸收的雜質(zhì)，溶劑必須在測定波長沒有吸收干擾；

b）樣品能完全溶解在溶劑中，形成均一透明的溶液，樣品如有懸浮或沉淀，則需過濾或離心以除去沉淀；

c）在測定的光譜范圍內(nèi)，樣品的吸光度值不應(yīng)超過2.0，最優(yōu)信噪比的吸光度值為0.86；

d）單晶樣品：需要足夠大且需合適的樣品架；

e）薄膜樣品：可以是透明的無機(jī)固體薄膜，也可以是有機(jī)高分子薄膜；

f）緩沖液與溶劑要求：緩沖液和溶劑在配制溶液前要做單獨(dú)的檢查，看是否在測定波長范圍內(nèi)有吸收干擾，看是否形成沉淀和膠狀；在蛋白質(zhì)測量中，經(jīng)常選擇透明性極好的磷酸鹽作為緩沖體系；

g）樣品濃度與池子選擇：樣品不同，測定的圓二色光譜范圍不同，對池子大小（光徑）的選擇和濃度的要求也不一樣；蛋白質(zhì)CD光譜測量一般在相對較稀的溶液中進(jìn)行；

4.圓二色光譜儀的主要技術(shù)性能優(yōu)勢

圓二色光譜儀的主要技術(shù)性能優(yōu)勢如下：

a）光通量大，特別的光學(xué)設(shè)計，大大地提高了光通量、光強(qiáng)度，能在全波長范圍都可得到很好的信噪比，保證檢測數(shù)據(jù)的真實(shí)性；

b）靈敏度高，可以檢測更細(xì)微的結(jié)構(gòu)信息，如帶寬可以小至0.1 nm、0.01 nm，從而能在檢測時得到精確、細(xì)微的指紋性結(jié)構(gòu)信息；

c）樣品（如有機(jī)合成物、蛋白樣品等）的用量少，可以用很微小的樣品池，如光程為0.01 mm（2.6 μL）、0.1 mm（26 μL）的樣品池；

d）檢測器的位置可以調(diào)節(jié)，在分析脂質(zhì)體等高光散射類樣品時，得到特別大的光通量；

e）直接分析溫度相關(guān)的CD光譜信息，從而得到熱力學(xué)分析信息。

5.圓二色光譜儀的主要應(yīng)用

由于生物大分子基本都含有手性的基團(tuán)和結(jié)構(gòu)，而圓二色光譜儀可以幫助測量和觀察生物大分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象變化，因此圓二色光譜技術(shù)成為生物物理和生物化學(xué)研究中的一個非常重要的手段，被廣泛應(yīng)用于有機(jī)化學(xué)，生物化學(xué)，配位化學(xué)和藥物化學(xué)等領(lǐng)域，其主要應(yīng)用如下[4-5]：

a）手性結(jié)構(gòu)測定：如官能團(tuán)的位置及特定原子在手性分子中的位置的測定；

b）構(gòu)型的測定：利用對應(yīng)關(guān)系和鄰近關(guān)系測定密切相關(guān)的一類化合物的相對構(gòu)型；利用八區(qū)律等一類經(jīng)驗(yàn)和半經(jīng)驗(yàn)的規(guī)律，結(jié)合其它方法測定絕對構(gòu)型；

c）手性介質(zhì)（包括溶劑和手性大分子）誘導(dǎo)的光學(xué)活性的研究，即一個非手性分子被外部介質(zhì)所誘導(dǎo)而產(chǎn)生光學(xué)活性；

d）溶劑效應(yīng)：研究溶劑與溶質(zhì)間的相互作用及該作用對分子的光學(xué)活性的影響；

e）圓二色光譜儀還可以用作光譜分析。

我們通過以下實(shí)例來進(jìn)一步說明圓二色光譜儀在科研中的應(yīng)用：

在分子生物學(xué)領(lǐng)域中，蛋白質(zhì)溶液的圓二色譜可以反映蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)信息。蛋白質(zhì)是氨基酸以肽鍵聯(lián)接而成的具有特定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子，其圓二色性表現(xiàn)為生色基團(tuán)和折疊結(jié)構(gòu)的總和。張強(qiáng)等人在《中華鱉裙邊膠原蛋白的提取、鑒定及其理化性質(zhì)》一文中利用Chirascan V100型圓二色光譜儀對膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[6]，實(shí)驗(yàn)中將凍干樣品溶于0.05 mol/L的乙酸中，配制成0.3 mg/mL的膠原蛋白溶液，取少量溶液加入2 mm比色皿中，放人圓二色光譜儀中，于25 ℃，190～250 nm 的波長下掃描3次，記錄各光譜曲線，結(jié)果如圖7所示。

由圖中可以看出，在25 ℃下ASC和PSC的特征圓二色光譜分別在224 nm和222 nm處出現(xiàn)正峰，這是左旋聚脯氨酸構(gòu)型的圓二色譜典型特征，根據(jù)結(jié)果分析，PSC的正/負(fù)吸收峰比值較ASC大，則說明PSC比ASC的三重螺旋結(jié)構(gòu)更完整。

圓二色光譜也常用于研究手性金納米粒子的微觀結(jié)構(gòu)和手性來源，韋克毅等人[7]將手性金納米粒子的CD光譜信號的變化與 Ag+的濃度相關(guān)聯(lián)，這種方法既拓展了金納米粒子的應(yīng)用范圍，又對Ag+的識別與檢測提供了新的方法。本實(shí)驗(yàn)的部分結(jié)果如圖8-9所示。

圖8和圖9分別為手性金納米粒子溶液中加入10 μmol/L Ag+后,在 0，0.5，1.0，3.0，4.0，6.0，7.5，10，11，14，15，20和25 min時的CD光譜以及在230 nm處CD光譜強(qiáng)度的猝滅圖。從圖中可以看出，手性金納米粒子的CD光譜強(qiáng)度隨著Ag+的加入迅速下降，最終趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定時間為12 min，從響應(yīng)時間的角度考慮，該方法可以應(yīng)用于Ag+的快速識別與檢測[7] 。

從上述的兩個實(shí)例中不難看出，圓二色光譜儀對于研究分子結(jié)構(gòu)不對稱性、手性結(jié)構(gòu)測定等具有重要作用，在人們的生產(chǎn)生活中扮演著極其重要的角色。

6.參考文獻(xiàn)

[1] 王建明. 過渡金屬配合物圓二色光譜的理論解析[D]. 2008.

[2] 張林群, 李穎, 楊紅曉. 圓二色光譜儀和旋光儀對手性藥物比旋度測定的比較[J]. 分析儀器, 2014, 000(006):64-68.

[3] 陳木子,等. AVIV410型圓二色光譜儀的使用及維護(hù)[M]. 2003(1).

[4] 丁曉嵐, 高紅旗. 圓二色光譜技術(shù)應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)方法[J]. 實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理(10):48-52.

[5] Xiaoyan Z , Enhua C , Xueguang S . Circular dichroism spectroscopic studies on structures formed by telomeric DNA sequences in vitro[J]. Chinese ence Bulletin, 2000, 45(21):1959-1963.

[6] 張強(qiáng), 黃鑫, 符安衛(wèi),等. 中華鱉裙邊膠原蛋白的提取，鑒定及其理化性質(zhì)[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2019, 045(012):176-182.

[7] 韋克毅, 王猛, 杜宇,等. 基于手性金納米粒子圓二色光譜法識別與檢測銀離子[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報, 2016, 55(004):601-605.

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