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實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)的問(wèn)題有哪些？

來(lái)源：測(cè)試GO 時(shí)間：2022-10-28 11:34:10 瀏覽：3758次

在科研人員進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)操作中遇到了不計(jì)其數(shù)的問(wèn)題，本文就給大家分享在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)頻率最高的一些問(wèn)題：

內(nèi)參基因COL1(擴(kuò)增曲線)

一、Ct值出現(xiàn)

檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤:一般SybrGreen法采用72℃延伸時(shí)采集，Taqman法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào)。

1、引物或探針降解:可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)其完整性。

2、模板量不足:對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。

3、模板降解:避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。

二、Ct值出現(xiàn)過(guò)晚（Ct>38）

1、擴(kuò)增效率低:反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計(jì)更好的引物或探針；改用三步法進(jìn)行反應(yīng)；適當(dāng)降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。

2、PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。

3、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng):一般采用80-150bp的產(chǎn)物長(zhǎng)度。

三、溶解曲線不止一個(gè)主峰

1、引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

2、引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

3、鎂離子濃度過(guò)高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。

4、模板有基因組的污染：RNA提取過(guò)程中避免基因組DNA的引入，或通過(guò)引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。

四、擴(kuò)增效率低

1、反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。

2、反應(yīng)條件不夠優(yōu)化：可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。

3、反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物：一般是加入模板時(shí)所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。

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