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如何輕松獲得生物TEM高逼格照片？（含樣品前處理）

來(lái)源：測(cè)試GO 時(shí)間：2022-08-09 10:08:26 瀏覽：4362次

01

透射電子顯微鏡

透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope, 簡(jiǎn)稱(chēng)TEM),可以看到在光學(xué)顯微鏡下無(wú)法看清的小于0.2 μm的細(xì)微結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)稱(chēng)為亞顯微結(jié)構(gòu)或超微結(jié)構(gòu)。要想看清這些結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長(zhǎng)更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。

大型透射電鏡(conventional TEM)一般采用80-300 kV電子束加速電壓，不同型號(hào)對(duì)應(yīng)不同的電子束加速電壓，其分辨率與電子束加速電壓相關(guān)，可達(dá)0.2-0.1 nm，高端機(jī)型可實(shí)現(xiàn)原子級(jí)分辨。采用透射電鏡常用的50～100 kV電子束來(lái)說(shuō)，樣品的厚度控制在10～100 nm為宜。

由于電鏡產(chǎn)生的電子束穿透能力很弱，必須把標(biāo)本切成厚度小于0.1 μm以下的薄片才適用，這種薄片稱(chēng)為超薄切片（Ultrathin sectioning），常用的超薄切片厚度是50～70 nm。超薄切片技術(shù)是為透射電鏡觀察提供薄樣品的專(zhuān)門(mén)技術(shù)，也是研究材料類(lèi)、生物類(lèi)樣品的基本技術(shù)，尤其是觀察細(xì)胞、組織、器官等的超微結(jié)構(gòu)與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)最常用的技術(shù)，還是電鏡細(xì)胞化學(xué)、免疫電鏡等的關(guān)鍵性技術(shù)。它在生物學(xué)的發(fā)展過(guò)程中占據(jù)重要的地位，目前各種細(xì)胞、組織的超微結(jié)構(gòu)知識(shí)幾乎都是由它提供的。

02

主要步驟及超薄切片要求

2.1主要步驟

取材→戊二醛預(yù)固定→鋨酸后固定→脫水、滲透→聚合包埋→半薄切片定位→超薄切片→電子染色→透射電鏡觀察

2.2生物樣品超薄切片要求

2.2.1 細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)保存良好，沒(méi)有明顯的物質(zhì)凝聚、丟失、添加等人工效應(yīng)；

2.2.2 切片厚度50～100 nm為宜：太薄反差低；太厚反差好，但結(jié)構(gòu)重疊，電子束不能穿透；

2.2.3 切片應(yīng)耐電子束的強(qiáng)烈照射，不變形不升華；

2.2.4 切片能夠適當(dāng)被染色，保證一定的反差；

2.2.5 切片均勻，無(wú)影響拍照的皺褶、刀痕或染色污染。

03

各步驟要求

3.1 取材和預(yù)固定

3.1.1 動(dòng)物普通組織

一般動(dòng)物組織的取材，要點(diǎn)一是減少缺血缺氧時(shí)間，二是減少機(jī)械損傷。麻醉或斷頸處死均可，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜅l件選擇。具體如下：

（1）請(qǐng)盡快用戊二醛固定液預(yù)固定。動(dòng)物組織最好在離體后1 min內(nèi)開(kāi)始固定。

（2）非灌注的組織，厚度不超過(guò)4 mm，請(qǐng)用恰當(dāng)方式（比如切成寬薄片）體現(xiàn)位置和層次關(guān)系。請(qǐng)盡量不要事先切成很小的顆粒。

（3）請(qǐng)用鋒利薄刀片切組織，朝一個(gè)方向劃，不要來(lái)回切割，不要擠壓、拉扯。

（4）含有食物殘?jiān)?、大量血液或其它黏附物的組織，請(qǐng)用生理鹽水漂洗，再投入預(yù)固定液。

（5）請(qǐng)保證固定液量充足。固定液和組織的體積比不小于20 : 1。

（6）最初的30 min以后，最好在4℃的固定液中浸泡，嚴(yán)禁結(jié)冰（太靠近冰箱后壁或冰袋運(yùn)輸都可能使組織結(jié)冰，冬季寧可常溫送樣）。

組織尺寸和容器關(guān)系（只裝一個(gè)的參考標(biāo)準(zhǔn)）：

芝麻到綠豆大?。ㄈ缧∈竽I上腺）：請(qǐng)用1.5 ml EP管；

黃豆大?。ㄐ∈竽I臟）：請(qǐng)用5 ml離心管；

鋪展面積類(lèi)似蠶豆大小的組織片：請(qǐng)用平底的25 ml廣口瓶；

每個(gè)容器含有N個(gè)組織時(shí)：

容器體積要適當(dāng)增大；組織不要相互擠壓變形。

3.1.2 動(dòng)物鈣化硬組織

基本的取材和預(yù)固定要求與普通組織相同。預(yù)固定充分后（至少過(guò)夜），轉(zhuǎn)入EDTA脫鈣固定液脫鈣。脫鈣務(wù)必充分，確保切片操作無(wú)障礙。

3.1.3 須灌注固定的動(dòng)物組織

小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腦深部組織、脊髓等不易快速取出固定的標(biāo)本，或需要大范圍、多器官取材時(shí)，可采用經(jīng)心臟灌注固定。固定液最好采用2%多聚甲醛+2.5%戊二醛。需要保全心臟相關(guān)結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)，或者要觀察肺組織充氣形態(tài)的實(shí)驗(yàn)禁用經(jīng)心臟灌注的方法。具體步驟如下：

（1）動(dòng)物恰當(dāng)麻醉，腹部朝上綁定在操作臺(tái)上。

（2）開(kāi)腹，有利于觀察灌注效果。不必觀察時(shí)，或某些需要保持腹腔器官原位置的實(shí)驗(yàn)，可直接開(kāi)胸。

（3）從劍突下小心剪破膈，使肺回縮（避免剪到肺造成出血）。隨后向兩側(cè)擴(kuò)大破口，與腹壁切口靠近。剪斷兩側(cè)肋骨，繼續(xù)向頭端擴(kuò)展切口，直到露出心房。

（4）夾持劍突，將胸廓整體向頭端外翻并固定，充分暴露心臟。

（5）用磨鈍的注射針頭從左心室穿刺（小型豬、貓、狗等心臟較厚實(shí)，須用尖刀稍剪破心尖組織少許再穿刺，但勿剪漏出血），針頭停留在左心室內(nèi)，輕推注射器確認(rèn)液體未漏出；然后用止血鉗將心壁和針頭一并夾持住，防止針頭位置移動(dòng)。（此步為灌注操作的關(guān)鍵，針尖務(wù)必留在左心室。如果發(fā)現(xiàn)穿破室間隔、房室隔或心壁，須繼續(xù)小心進(jìn)針，直到針頭進(jìn)入升主動(dòng)脈，然后仍?shī)A持心臟。）

（6）灌注預(yù)熱到體溫的生理鹽水，同時(shí)剪破右心耳放血，直到右心耳流出的液體基本不帶血色。該過(guò)程控制在1 min內(nèi)完成。（最好有壓力控制裝置。如果沒(méi)有，最好采用吊瓶，瓶的懸掛高度應(yīng)通過(guò)動(dòng)物血壓的厘米水柱數(shù)值估計(jì)。小鼠、大鼠等一般掛在高于動(dòng)物身體1.5 m處。）

（7）停止鹽水灌注，通過(guò)三通管換用固定液繼續(xù)灌注（室溫）。初始速度與鹽水一致；當(dāng)動(dòng)物開(kāi)始強(qiáng)烈抽搐后，降低流速，從輸液器膠囊觀察窗看，維持每秒2滴。小鼠建議液量30 ml，大鼠至少100 ml，貓約500 ml，并以此估計(jì)其他小動(dòng)物用量。

（8）固定液灌注過(guò)程中，觀察動(dòng)物肢體是否充分僵硬，黏膜、內(nèi)臟等是否充分褪去血色。如果灌注液用量過(guò)半仍沒(méi)有這些現(xiàn)象，立即終止灌注，行搶救性切割取材。

（9）灌注完成后，撤去灌注器械。如果灌注成功，小心轉(zhuǎn)移動(dòng)物尸體到潔凈托盤(pán)中。最好用浸濕固定液的雙層紗布仔細(xì)覆蓋動(dòng)物，再覆蓋一層保鮮膜，室溫等待1 h。（等待1 h的目的是使組織充分定型、硬化，減少手術(shù)切割時(shí)產(chǎn)生的機(jī)械損傷。不確定是否灌注成功時(shí)可不等待立即取材。）

（10）常規(guī)手術(shù)取材、切割標(biāo)本，浸泡固定30 min后轉(zhuǎn)入4℃冰箱過(guò)夜（此步驟同普通組織取材）。

3.1.4 植物組織

植物組織取材需注意時(shí)間因素。同批實(shí)驗(yàn)各組應(yīng)在一天中的大致同一時(shí)刻取材，否則淀粉粒等細(xì)胞內(nèi)含物差異很大。植物樣品固定初期常漂浮于液面，應(yīng)備好壓沉用的脫脂棉。具體取材要求如下：

（1）在恰當(dāng)時(shí)間，用鋒利剪刀剪下葉片或其他待觀察結(jié)構(gòu)。寬葉片務(wù)必在保留待觀察區(qū)域的前提下剪小；較粗的根必須切開(kāi)固定；須根或其它細(xì)小結(jié)構(gòu)盡可能截短以增加滲透效果。裁剪時(shí)避免機(jī)械損傷，并注意保留判斷標(biāo)本方向的結(jié)構(gòu)線索。

（2）組織浸入足量戊二醛預(yù)固定液（與動(dòng)物組織要求相同），再用適量潔凈脫脂棉壓在組織上方，確保組織完全浸沒(méi)在液面下。

（3）4℃固定過(guò)夜后送樣。

3.1.5 細(xì)胞低速離心收集方法

本法是改良的細(xì)胞離心收集方法，細(xì)胞結(jié)構(gòu)更精細(xì)，無(wú)高速離心帶來(lái)的影響，細(xì)胞數(shù)量控制不佳（偏多或偏少）也不影響制樣。本法也可用于血液、精液、脫落細(xì)胞等其它樣品的收集。具體操作如下：

（1）最好刮取細(xì)胞，收集在離心管中，1000 rpm離心5 ~ 10 min（初次離心參數(shù)可按自己的經(jīng)驗(yàn)調(diào)整，目的是不損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)的情況下去掉培養(yǎng)液成分）。

（2）棄上清，加入常溫（平時(shí)固定液4℃保存，臨用前拿出復(fù)溫到室溫或體溫）的戊二醛預(yù)固定液，重懸細(xì)胞。常溫固定2 min。4℃固定也可，除微管骨架破壞以外，無(wú)顯著差異。

（3）轉(zhuǎn)移至1.5 ml尖底EP管，2000 rpm離心10 min。此步離心后，細(xì)胞應(yīng)為約半顆綠豆大小。

（4）用吸管小心棄上清，加入室溫的0.1M PB或等滲PBS，重懸細(xì)胞。再以1000 rpm離心5 ~10 min。

（5）以相同條件重復(fù)上述重懸、離心步驟，再次漂洗細(xì)胞（不要偷懶，要洗第二遍）。

（6）用吸管小心棄上清，加入預(yù)熱到40℃的GT2專(zhuān)用溶液重懸細(xì)胞（輕輕搖勻或吹吸均可，不要有肉眼可見(jiàn)的大塊）；立即以3000 rpm離心10 min。

（7）用吸管盡快小心棄上清；然后密閉管蓋，轉(zhuǎn)入4℃靜置10 min（嚴(yán)禁結(jié)冰）。

（8）沿管壁緩慢加入戊二醛預(yù)固定液，不要沖擊細(xì)胞團(tuán)，靜置30 min后可送樣。

請(qǐng)?jiān)?~10℃保存或運(yùn)輸，嚴(yán)禁結(jié)冰（太靠近冰箱后壁或冰袋運(yùn)輸都可能使樣品結(jié)冰，冬季寧可常溫送樣）。

3.1.6 細(xì)胞高速離心收集方法

本方法過(guò)去被大多數(shù)單位采用，沒(méi)有“GT2”時(shí)的應(yīng)急取材也可使用。但是，高速離心可能造成某些結(jié)構(gòu)變形。此外，如果細(xì)胞團(tuán)太小，制樣過(guò)程中有損失的風(fēng)險(xiǎn)；細(xì)胞團(tuán)太大，必然滲透不良，拉低該管細(xì)胞的整體制樣質(zhì)量。故控制細(xì)胞離心團(tuán)的大小十分重要。具體操作如下：

（1）最好刮取細(xì)胞，收集在離心管中，1500 rpm離心10 min（該參數(shù)可按自己的經(jīng)驗(yàn)調(diào)整，目的是不損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)的情況下去掉培養(yǎng)液成分）。

（2）棄上清，加入用0.1 M PB稀釋到1/5（體積比1:4）的3%戊二醛重懸細(xì)胞。

（3）細(xì)胞懸液盡快轉(zhuǎn)移至1.5 ml尖底EP管，立即以10000 rpm離心10 ~ 12 min（該參數(shù)適用于一般小型臺(tái)式離心機(jī)，不可隨意更改，務(wù)必使細(xì)胞離緊不散）；離緊后的細(xì)胞約半顆綠豆大小，切不可偏差太大。

（4）用吸管小心棄上清，再沿管壁小心、緩慢加入室溫或4℃預(yù)冷的固定液（不可吹散細(xì)胞），靜置30 min以上。

（5）在4 ~ 10℃保存或運(yùn)輸。嚴(yán)禁結(jié)冰（太靠近冰箱后壁或冰袋運(yùn)輸都可能使組織結(jié)冰，冬季寧可常溫送樣）。

3.2雙固定法

固定的目的主要是終止組織細(xì)胞的生化過(guò)程，同時(shí)把它們的超微結(jié)構(gòu)改變控制在最小范圍內(nèi)，并保護(hù)這些結(jié)構(gòu)在后續(xù)的脫水、包埋等過(guò)程中不被破壞；常用雙固定法，用一定濃度的戊二醛對(duì)樣品預(yù)固定，漂洗后使用鋨酸對(duì)樣品進(jìn)行后固定。戊二醛的滲透性好，可保存蛋白質(zhì)、酶活性，穩(wěn)定糖元，可長(zhǎng)時(shí)固定（低溫可長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月）。鋨酸是強(qiáng)氧化劑，固定脂類(lèi)、膜結(jié)構(gòu)，有電子染色作用。

3.3脫水

用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑取代組織和細(xì)胞中的游離態(tài)水分，使之能與包埋劑混合。脫水要徹底，更換液體動(dòng)作要迅速，脫水時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，且固定后的樣品要充分漂洗。脫水劑：乙醇、丙酮、環(huán)氧丙烷等，脫水步驟主要是逐級(jí)梯度脫水：30％→50％→70％→80％→90％→95％(以上步驟每次10～20 min)→100％(2～3次，每次15min)→100％丙酮(20min)

3.4滲透、包埋與聚合

3.4.1滲透

用包埋樹(shù)脂或其混合液逐漸取代組織內(nèi)的脫水劑，細(xì)胞內(nèi)外所有的空隙被滲透填充，使包埋劑逐步滲透到組織細(xì)胞內(nèi)部，以便與細(xì)胞外的包埋劑同時(shí)聚合。滲透劑依次為丙酮：環(huán)氧樹(shù)脂（2：1）、丙酮：環(huán)氧樹(shù)脂（1：1）、丙酮：環(huán)氧樹(shù)脂（1：3）、環(huán)氧樹(shù)脂，37℃溫箱內(nèi)，每次滲透8-12h。

3.4.2包埋與聚合

將滲透好的樣品塊放入到適當(dāng)?shù)陌衲＞咧?，灌裝上純包埋劑（常用Epon 812、Spurr、LR White等）包埋。加溫在60℃聚合形成固體基質(zhì)，牢固地支撐整個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)或組織，制成適于機(jī)械切割的固體樹(shù)脂包埋塊，利于切片。

3.5超薄切片

3.5.1制刀與切片厚度

常用玻璃刀、鉆石刀進(jìn)行超薄切片，刀上要裝水槽，并注入槽液。切片厚度50～100 nm為宜：太薄反差低；太厚反差好，但結(jié)構(gòu)重疊，電子束不能穿透。

3.5.2切片步驟

切片步驟：裝塊→裝刀→對(duì)刀→加水→切片→撈片。切片應(yīng)耐電子束的強(qiáng)烈照射，不變形不升華；切片能夠適當(dāng)被染色，保證一定的反差；切片均勻，無(wú)皺褶、刀痕，無(wú)染色劑或其他化學(xué)物質(zhì)的沉淀。生物組織樣品在超薄切片前，還須進(jìn)行半薄切片，在光學(xué)顯微鏡下確定所需觀察的部位。

3.6染色

利用高密度的重金屬染色劑（鈾）與細(xì)胞某些微細(xì)結(jié)構(gòu)或成分結(jié)合，以增加樣品局部的電子散射能力，提高電鏡圖像反差。染色實(shí)質(zhì)上是增大電子密度，使電鏡圖像灰度不同。染色方法有單染，包括鉛鹽單染和鈾鹽單染；雙染色，醋酸鈾染色和檸檬酸鉛染色。雙染色呈現(xiàn)結(jié)果更全面，我們一般采用的雙染法進(jìn)行染色。常用染色劑：醋酸鈾，有微弱的放射性，主要染核酸、核蛋白、細(xì)胞核、結(jié)締組織。檸檬酸鉛，主要染膜結(jié)構(gòu)、脂類(lèi)、糖原等。易與CO₂反應(yīng)成沉淀，染色中應(yīng)采取措施避免。

雙染色步驟：

雙染色：醋酸雙氧鈾染色→漂洗→檸檬酸鉛染色→漂洗→干燥。

3.7電鏡觀察

選取需要觀察的位置，進(jìn)行拍照采集圖像。

04

案例展示（由測(cè)試狗提供服務(wù)支持）

4.1動(dòng)物樣品測(cè)試案例展示

案例1：關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，×4000，2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定，強(qiáng)滲透浸膠包埋。

案例2：中度缺氧改變的心肌線粒體，×5000，常規(guī)固定和制樣

案例3：大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞，×5000，經(jīng)血管灌注固定，常規(guī)制樣

案例4：胃底腺分泌狀態(tài)的壁細(xì)胞，×3000，常規(guī)固定和制樣

案例5：小鼠膽囊上皮，×3000，常規(guī)固定和制樣

案例6：小鼠肝臟低倍大視野，×700，常規(guī)固定和制樣

案例7：老年小鼠腎小球?yàn)V過(guò)屏障，×5000，常規(guī)固定和制樣

測(cè)試狗

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