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精華|HPLC最實(shí)用的30個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題及對(duì)策（一）

來(lái)源：實(shí)驗(yàn)與分析時(shí)間：2015-09-03 23:59:36 瀏覽：4404次

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精華|HPLC最實(shí)用的30個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題及對(duì)策（一）

高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。以制藥領(lǐng)域?yàn)槔何覈?guó)藥典收載高效液相色譜法項(xiàng)目和數(shù)量比較表：

鑒于HPLC在全行業(yè)運(yùn)用越來(lái)越廣泛，因此每一個(gè)實(shí)驗(yàn)室分析人員都應(yīng)該熟練掌握并應(yīng)用HPLC，對(duì)于一些常見(jiàn)的故障分析應(yīng)該做到游刃有余，才能在運(yùn)行故障的時(shí)候即使解決問(wèn)題，提高工作效率。小編整理了約30條常見(jiàn)HPLC故障及對(duì)策分析方案，分為三天推送，大家不要錯(cuò)過(guò)哦。

保留時(shí)間發(fā)生漂移或快速變化原因？

關(guān)于漂移問(wèn)題：

① 溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定；

② 流動(dòng)相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動(dòng)相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等；

③ 柱子未平衡好，需對(duì)柱子進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的平衡。

關(guān)于快速變化問(wèn)題

① 流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定；

② 泵中有氣泡，可通過(guò)排氣等操作將氣泡趕出；

③ 流動(dòng)相不合適，解決辦法為改換流動(dòng)相或使流動(dòng)相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合。

出現(xiàn)拖尾或雙峰的原因？

① 篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子；

② 存在干擾峰，解決辦法為使用較長(zhǎng)的柱子；改換流動(dòng)相或更換選擇性好的柱子；

③ 可能柱超載，減少進(jìn)樣量。

HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法

① 樣品量不足，解決辦法為增加樣品量；

② 樣品未從柱子中流出?？筛鶕?jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子；

③ 樣品與檢測(cè)器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長(zhǎng)或改換檢測(cè)器；

④ 檢測(cè)器衰減太多。調(diào)整衰減即可；

⑤ 檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)太大。解決辦法為降低時(shí)間參數(shù)；

⑥ 檢測(cè)器池窗污染。解決辦法為清洗池窗；

⑦ 檢測(cè)池中有氣泡。解決辦法為排氣；

⑧ 記錄儀測(cè)壓范圍不當(dāng)。調(diào)整電壓范圍即可；

⑨ 流動(dòng)相流量不合適。調(diào)整流速即可；

⑩ 檢測(cè)器與記錄儀超出校正曲線(xiàn)。解決辦法為檢查記錄儀與檢測(cè)器，重作校正曲線(xiàn)。

做HPLC分析時(shí)，柱壓不穩(wěn)定，原因何在？如何解決？

① 泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對(duì)溶劑進(jìn)行脫氣處理；

② 比例閥失效，更換比例閥即可；

③ 泵密封墊損壞，更換密封墊即可；

④ 溶劑中的氣泡，解決的辦法是對(duì)溶劑脫氣，必要時(shí)改變脫氣方法；

⑤ 系統(tǒng)檢漏，找出漏點(diǎn)，密封即可；

⑥ 梯度洗脫，這時(shí)壓力波動(dòng)是正常的。

更換了另一種牌號(hào)ODS柱，但保留時(shí)間不能重現(xiàn)，為什么？

這是因?yàn)楸环治鑫锟赡芫哂行纬蓺滏I的能力。盡管過(guò)去幾年來(lái)，填料的制造技術(shù)有了極大的提高，但不同的廠商的ODS填料表面硅醇基的濃度不同。正是這些硅醇基可能與樣品發(fā)生相互作用。因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號(hào)的ODS柱上的相對(duì)保留時(shí)間就可能不同。在流動(dòng)相中加入少量競(jìng)爭(zhēng)物，如三乙基胺（TEA），將會(huì)使硅醇基的成鍵能力飽和，從而能保證不同牌號(hào)柱子上的相對(duì)保留時(shí)間具有較好的重現(xiàn)性。如分離情況可以，系統(tǒng)穩(wěn)定，達(dá)到系統(tǒng)適用性要求，就不必保留時(shí)間的重現(xiàn)。

HPLC柱驗(yàn)收測(cè)試時(shí)柱壓過(guò)高為什么？

柱壓過(guò)高是HPLC柱用戶(hù)最常碰到的問(wèn)題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問(wèn)題，您可按下面步驟檢查問(wèn)題的起因。

① 拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問(wèn)題，若柱壓仍高，再檢查；

② 把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查；

③ 將柱子的進(jìn)出口反過(guò)來(lái)接在儀器上，用10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗柱子，（此時(shí)不要連接檢測(cè)器，以防固體顆粒進(jìn)入流動(dòng)池）。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，再檢查；只用于使用過(guò)的柱子。

④ 更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說(shuō)明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請(qǐng)與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進(jìn)樣器與保護(hù)柱之間接一個(gè)在線(xiàn)過(guò)濾器便可避免柱壓過(guò)高的問(wèn)題，SGE提供的Rheodyne 7315型，過(guò)濾器就是解決這一問(wèn)題的最佳選擇。

色譜柱中的流動(dòng)相會(huì)排干嗎？

不少做色譜分離試驗(yàn)的人遇到過(guò)這樣的情形：不慎未及時(shí)補(bǔ)充流動(dòng)相，泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干了，HPLC系統(tǒng)由此而停止工作了。如此情況是否會(huì)損壞色譜柱？泵是否已將色譜柱中所有流動(dòng)相都排干了？色譜柱還能使用嗎？事實(shí)上，如果泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干，并不會(huì)造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿(mǎn)了空氣，泵也不會(huì)將空氣排入色譜柱。因?yàn)楸弥荒茌斔鸵后w，而不能輸送空氣。

相比之下，另一個(gè)更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣，整個(gè)色譜柱干涸的情況不太容易發(fā)生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個(gè)毫米變干了，因揮發(fā)掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。即使色譜柱真的變干了，也不一定就不可救藥了?？梢試L試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑（如經(jīng)氦氣脫氣的甲醇）沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤(rùn)填料表面；已脫氣的溶劑應(yīng)該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要（以1mL/min的流速）沖一個(gè)小時(shí)或更多的時(shí)間被徹底浸潤(rùn)，恢復(fù)到正常狀態(tài)。

基線(xiàn)漂移原因、解決方法

1.原因分析

① 柱溫波動(dòng)。（即使是很小的溫度變化都會(huì)引起基線(xiàn)的波動(dòng)。通常影響示差檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器、較低靈敏度的紫外檢測(cè)器或其它光電類(lèi)檢測(cè)器。）

②流動(dòng)相不均勻。（流動(dòng)相條件變化引起的基線(xiàn)漂移大于溫度導(dǎo)致的漂移。）

③流通池被污染或有氣體

④檢測(cè)器出口阻塞。（高壓造成流通池窗口破裂，產(chǎn)生噪音基線(xiàn)）

⑤流動(dòng)相配比不當(dāng)或流速變化

⑥柱平衡慢，特別是流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)

⑦流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成

⑧樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)（高K’值）以饅頭峰

樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個(gè)逐步升高的基線(xiàn)。

⑨使用循環(huán)溶劑，不提倡。未調(diào)整檢測(cè)器。

⑩檢測(cè)器沒(méi)有設(shè)定在最大吸收波長(zhǎng)處。

2.解決方法

①控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，在檢測(cè)器之前使用熱交換器

②使用HPLC級(jí)的溶劑，高純度的鹽和添加劑。流動(dòng)相在使用前進(jìn)行脫氣，使用中使用在線(xiàn)脫氣或氦氣脫氣。

③用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用鹽酸）
④取出阻塞物或更換管子。參考檢測(cè)器手冊(cè)更換流通池窗。

⑤更改配比或流速。為避免這個(gè)問(wèn)題可定期檢查流動(dòng)相組成及流速。

⑥用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗，更改流動(dòng)相時(shí)，在分析前用10-20倍體積的新流動(dòng)相對(duì)柱子進(jìn)行沖洗。使用離子對(duì)試劑、緩沖鹽更應(yīng)注意平衡柱。

⑦檢查流動(dòng)相的組成。使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級(jí)的溶劑 ⑧改變分析條件。使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間或在分析過(guò)程中，定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。

⑨重新設(shè)定基線(xiàn)。使用新的流動(dòng)相。

⑩將波長(zhǎng)調(diào)整至最大吸收波長(zhǎng)處。重選檢測(cè)波長(zhǎng)。

規(guī)則的基線(xiàn)噪音產(chǎn)生的原因？

原因

①在流動(dòng)相、檢測(cè)器或泵中有空氣（尖銳峰）

②漏液。

③流動(dòng)相混合不完全。

④溫度影響（柱溫過(guò)高，檢測(cè)器未加熱）

⑤在同一條線(xiàn)上有其他電子設(shè)備（偶然噪聲）

⑥泵振動(dòng) 。

解決方法

①流動(dòng)相脫氣。沖洗系統(tǒng)以除去檢測(cè)器或泵中的空氣。

②檢查管路接頭是否松動(dòng)，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封。

③用手搖動(dòng)使混合均勻或使用低粘度的溶劑

④減少差異或加上熱交換器

⑤斷開(kāi)LC、檢測(cè)器和記錄儀，檢查干擾是否來(lái)自于外部，加以更正。采用精密級(jí)穩(wěn)壓電源。

⑥在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器。

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