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紫外可見(jiàn)分光光度法的原理及應(yīng)用

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紫外-可見(jiàn)分光光度法，又稱紫外-可見(jiàn)吸收光譜法（ultraviolet and visible spectrum），是以紫外線-可見(jiàn)光區(qū)域（通常200-800 nm）電磁波連續(xù)光譜作為光源照射樣品，研究物質(zhì)分子對(duì)光吸收的相對(duì)強(qiáng)度的方法。物質(zhì)中的分子或基團(tuán)，吸收了入射的紫外-可見(jiàn)光能量，電子間能級(jí)躍遷產(chǎn)生具有特征性的紫外-可見(jiàn)光譜，可用于確定化合物的結(jié)構(gòu)和表征化合物的性質(zhì)。紫外-可見(jiàn)吸收光譜在化學(xué)、材料、生物、醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。

紫外-可見(jiàn)分光光度法原理及應(yīng)用演示參考圖1

圖1 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（Ultraviolet-visible Spectrophotometer）

物質(zhì)的吸收光譜本質(zhì)上就是物質(zhì)中的分子、原子等，吸收了入射光中某些特定波長(zhǎng)的光能量，并相應(yīng)地發(fā)生躍遷吸收的結(jié)果。紫外-可見(jiàn)吸收光譜就是物質(zhì)中的分子或基團(tuán)，吸收了入射的紫外可見(jiàn)光能量，產(chǎn)生了具有特征性的帶狀光譜。

1. 紫外-可見(jiàn)吸收光譜法原理

1.1 分子光譜的產(chǎn)生以及類(lèi)型

分子中有電子的運(yùn)動(dòng)，組成分子的各原子間的振動(dòng)，以及分子作為整體的轉(zhuǎn)動(dòng)，這三種不同的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)都對(duì)應(yīng)一定的能級(jí)。光和物質(zhì)相互作用時(shí)，分子中電子能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)產(chǎn)生變化，使分子對(duì)光產(chǎn)生了吸收、發(fā)射或散射，從而得到分子光譜。分子從外界吸收光能，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，把被吸收的輻射強(qiáng)度按波長(zhǎng)順序記錄下來(lái)，便得到吸收光譜，如圖2所示。

紫外-可見(jiàn)分光光度法原理及應(yīng)用演示參考圖2

圖2 吸收光譜示意圖

紫外-可見(jiàn)分光光度法原理及應(yīng)用演示參考圖3

圖3 光譜分類(lèi)

根據(jù)光輻射的波長(zhǎng)范圍和作用形式的不同，如圖3所示，分子光譜包括紫外-可見(jiàn)光譜、紅外光譜、微波譜、熒光光譜和拉曼光譜等。

1.2 紫外-可見(jiàn)吸收光譜的電子躍遷

有機(jī)化合物的紫外吸收光譜：基態(tài)有機(jī)化合物的價(jià)電子包括成鍵δ電子、成鍵π電子和非鍵電子n。分子的空軌道包括反鍵δ*和反鍵π*軌道。因此，可能得躍遷為δ→δ*、π→π*、n→δ*、n→π*等。由圖4可見(jiàn)，各種躍遷所需能量大小為：δ→δ*＞n→δ*≥π→π*＞n→π*。

紫外-可見(jiàn)分光光度法原理及應(yīng)用演示參考圖4

圖4 有機(jī)化合物中電子躍遷類(lèi)型

無(wú)機(jī)化合物的紫外吸收光譜：①電荷遷移躍遷：化合物中的電荷發(fā)生重新分布，導(dǎo)致電荷從化合物的一部分遷移至另一部分。②配位場(chǎng)躍遷：在配位的配位場(chǎng)作用下，產(chǎn)生d→d*和f→f*躍遷。當(dāng)過(guò)渡金屬離子與顯色劑形成絡(luò)合物時(shí)，既存在電荷轉(zhuǎn)移吸收，又存在配位體吸收。

1.3 輻射吸收定律（朗伯-比耳定律）

如圖5所示，當(dāng)一束平行單色光照射溶液時(shí)，一部分光被溶液吸收，一部分被界面反射，其余光則透過(guò)溶液。我們把透射光強(qiáng)度(It)與入射光強(qiáng)度(Io)的比值It/Io稱為透光度（Transmittance, T）。溶液對(duì)光的吸收程度常用吸光度（Absorbance, A）表示。吸光度A定義為透光度的負(fù)對(duì)數(shù)或透光度倒數(shù)的對(duì)數(shù)，即A=-lgT。

紫外-可見(jiàn)分光光度法原理及應(yīng)用演示參考圖5

圖5 光通過(guò)溶液的情況

朗伯-比耳定律的物理意義是當(dāng)一束平行單色光通過(guò)單一均勻的、非散射的吸光物質(zhì)溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。如果物質(zhì)中只有一種吸光組分，則朗伯-比耳定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式為A=K·C·L，吸收系數(shù)K與入射輻射的波長(zhǎng)以及吸收物質(zhì)的性質(zhì)有光，K的單位為L(zhǎng)/g·cm。若濃度的單位為mol/L，則K的單位為L(zhǎng)/mol·cm，也稱為摩爾吸收系數(shù)ε。

2. 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)

分光光度法使用的儀器是分光光度計(jì)。分光光度計(jì)是由光源、分光系統(tǒng)（單色器）、吸收池、檢測(cè)器和測(cè)量信號(hào)顯示系統(tǒng)（記錄裝置）這五個(gè)基本部件組成的，如圖6所示。由光源產(chǎn)生的復(fù)合光通過(guò)單色器分解為單色光，當(dāng)單色光通過(guò)吸收池時(shí)，一部分光被樣品吸收，未被吸收的光到達(dá)接收放大器，將光信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)并加以放大，放大后的電信號(hào)再顯示或記錄下來(lái)。

紫外-可見(jiàn)分光光度法原理及應(yīng)用演示參考圖6

圖6 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)示意圖

光源：對(duì)光源的的基本要求是在廣發(fā)的光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射連續(xù)光譜；有足夠的輻射強(qiáng)度；光源有良好的穩(wěn)定性；輻射能量隨波長(zhǎng)沒(méi)有明顯的變化。在紫外及可見(jiàn)分光光度計(jì)上，常用的光源是鎢絲燈和氫燈（氘燈）。鎢絲燈受熱造成鎢蒸發(fā)損耗，可加入適量鹵素或鹵化物構(gòu)成鹵鎢燈，延長(zhǎng)使用壽命。

單色器：將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出任一波長(zhǎng)單色光的光學(xué)系統(tǒng)。如圖8所示，主要由狹縫、色散原件和透鏡系統(tǒng)組成。

紫外-可見(jiàn)分光光度法原理及應(yīng)用演示參考圖7

圖7 不同光源適用波長(zhǎng)范圍

紫外-可見(jiàn)分光光度法原理及應(yīng)用演示參考圖8

圖8 單色器光路示意圖

吸收池：又叫比色皿，如圖9所示，用于盛放待測(cè)溶液和決定透光液層厚度的器件。主要由石英吸收池和玻璃吸收池兩種。石英吸收池適用于紫外及可見(jiàn)光區(qū)，玻璃吸收池只能用于可見(jiàn)光區(qū)。

圖9 不同型號(hào)的比色皿

檢測(cè)器：利用光電效應(yīng)將透過(guò)吸收池的光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。常用的有光電管、光電倍增管、光電二極管、光電攝像管等。

3. 測(cè)試分析及應(yīng)用

3.1試樣制備

溶劑的選擇：選擇溶劑的一般原則是對(duì)試樣有良好的溶解能力和選擇性；測(cè)定在該波段溶劑本身無(wú)明顯吸收；溶劑不與被測(cè)組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；被測(cè)組分在溶劑中具有良好的吸收峰形。盡量選用低極性溶劑，溶劑極性較高時(shí)物質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)消失，只得到很寬的吸收峰。

比色皿的使用：透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭干凈，注意比色皿的配對(duì)使用，比色皿內(nèi)的溶液以皿高的2/3至4/5為宜。

3.2 定性分析

①把試樣的光譜特征，如吸收峰的數(shù)目、位置、強(qiáng)度（摩爾吸收系數(shù)）以及吸收峰的形狀（極大、極小和拐點(diǎn)），與純化合物或者文獻(xiàn)報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)紫外光譜圖做比較，推測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)，檢查化合物的純度。

紫外-可見(jiàn)分光光度法原理及應(yīng)用演示參考圖10

圖10 ALE-ZnONPs、ALE和ZnSO4的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖

實(shí)例：沙特阿拉伯國(guó)王大學(xué)Mansour S. Al-Said等人[1]利用紫外-可見(jiàn)吸收光譜確定所制備的樣品ALE-ZnONPs中含有氧化鋅納米顆粒。如圖10所示，樣品ALE-ZnONPs在375 nm出現(xiàn)了特征峰，制備樣品的原材料ALE和ZnSO4在該處無(wú)特征峰。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，納米氧化鋅的特征峰在358-375 nm之間，由此證實(shí)了氧化鋅納米顆粒的生成。

②根據(jù)吸收峰的強(qiáng)弱對(duì)比比較樣品的相關(guān)性質(zhì)。一種化合物可能擁有多個(gè)吸收峰，這些峰的相對(duì)強(qiáng)弱變化可以推測(cè)出化合物的相關(guān)性質(zhì)。首先是根據(jù)文獻(xiàn)了解化合物的每個(gè)吸收峰所代表的含義，再進(jìn)行對(duì)比。

紫外-可見(jiàn)分光光度法原理及應(yīng)用演示參考圖11

圖11 P2-rn、P3-rn溶解性光學(xué)照片和紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖。

（溶劑：1,2,4-三氯苯，濃度：2-10-5mol/L）

實(shí)例：以基于異靛藍(lán)的聚合物P2-rn和P3-rn為例進(jìn)行說(shuō)明[2]。在這類(lèi)基于異靛藍(lán)的 D-A聚合物中，一般具有兩個(gè)吸收帶，band I和band II。band I又細(xì)分為0-0峰和0-1峰等，其中0-0峰表示分子的聚集狀態(tài)，越高說(shuō)明聚集越強(qiáng)。這兩個(gè)聚合物結(jié)構(gòu)的差異僅在其中一條烷基側(cè)鏈的大小不同，P3-rn的烷基側(cè)鏈比P3-rn的多出8個(gè)C原子。

從圖11中紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖可以看出，從P2-rn到P3-rn，0-0峰的強(qiáng)度/0-1峰的強(qiáng)度減小，說(shuō)明P3-rn在溶液中的聚集更弱，這和溶解性對(duì)比圖所示相吻合，相同濃度下，P3-rn的溶解性明顯較好，即分子更不易聚集，分散的更好。

3.3 半定量分析

根據(jù)吸收峰的強(qiáng)弱對(duì)比比較樣品的濃度大小關(guān)系。

實(shí)例：四川大學(xué)的郭熠等人[3]利用紫外-可見(jiàn)吸收光譜對(duì)比了溶液中多硫化鋰的含量，從而進(jìn)一步對(duì)比了樣品GSVm和GSm對(duì)多硫化鋰的吸附能力的強(qiáng)弱。將樣品GSVm和GSm分別放入相同濃度的多硫化鋰溶液中，靜置一段時(shí)間。樣品吸附多硫化鋰后，溶液中的多硫化鋰濃度改變。如圖12所示，測(cè)定吸附后溶液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，對(duì)比吸收峰的強(qiáng)弱，可以看出相較于原始的多硫化鋰溶液，加入樣品GSVm和GSm吸附后的多硫化鋰溶液吸收峰強(qiáng)度均降低，并且加入樣品GSVm吸附后的多硫化鋰溶液吸收峰強(qiáng)度下降更多，說(shuō)明樣品GSVm吸附多硫化鋰能力更強(qiáng)，使溶液中多硫化鋰濃度下降更多。

紫外-可見(jiàn)分光光度法原理及應(yīng)用演示參考圖12

圖12 浸泡了GSVm和GSm的 Li2Sn 溶液的光學(xué)照片(插圖)和吸附后對(duì)應(yīng)溶液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖。

3.4 定量分析

單組分定量分析：①標(biāo)準(zhǔn)曲線法：直接分取標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行光度測(cè)定或顯色測(cè)定所測(cè)得的吸光度與濃度作圖得到的曲線（圖13）。②標(biāo)準(zhǔn)加入法（增量法）：把未知試樣溶液分成體積相同的若干份，除其中的一份不加入被測(cè)組分標(biāo)準(zhǔn)試樣外，在其他幾份中都分別加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)試樣，然后測(cè)定各份試液的吸光度，并繪制吸光度對(duì)增量的校正曲線（圖14）。

紫外-可見(jiàn)分光光度法原理及應(yīng)用演示參考圖13

圖13 標(biāo)準(zhǔn)曲線法校正曲線

紫外-可見(jiàn)分光光度法原理及應(yīng)用演示參考圖14

圖14 增量法校正曲線

多組分定量分析：在多組分體系中，如果各組分對(duì)光都有吸收并且無(wú)相互作用，這時(shí)體系的總吸光度則等于各個(gè)組分的吸光度加和，這就是光吸收的加和特性。解決多組分混合物中各個(gè)組分測(cè)定的基礎(chǔ)是吸光度的加和性。對(duì)于一個(gè)含有多種吸光組分的溶液，在某一測(cè)定波長(zhǎng)下，其總吸光度應(yīng)為各個(gè)組分的吸光度之和。

示差分光光度法：普通分光光度測(cè)定在很低或者很高吸光度范圍內(nèi)進(jìn)行定量分析時(shí)相對(duì)誤差較大，因此不適于高含量或痕量物質(zhì)的分析，可以采用示差分光光度法進(jìn)行測(cè)定。示差分光光度是用一個(gè)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為參比，與未知濃度的試樣溶液比較，測(cè)量其吸光度。

紫外-可見(jiàn)分光光度法原理及應(yīng)用演示參考圖15

圖15 示差法校正曲線

實(shí)例：昆明醫(yī)科大學(xué)的鄧菊慶等人[4]采用紫外分光光度法測(cè)定了5種柑橘皮中總黃酮的含量。將樣品溶液、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液、空白對(duì)照液顯色后在200～800nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，選定最大吸收峰510 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖16），進(jìn)行線性回歸。從線性相關(guān)方程計(jì)算出相應(yīng)的黃酮濃度C，再換算成提取液中總黃酮的質(zhì)量，從而計(jì)算出總黃酮含量。

紫外-可見(jiàn)分光光度法原理及應(yīng)用演示參考圖16

圖16 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.5 原位紫外-可見(jiàn)吸收光譜法

通過(guò)原位紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖中吸收峰位置或者強(qiáng)度的變化可以分析樣品在反應(yīng)過(guò)程中的成分變化或者濃度變化。

紫外-可見(jiàn)分光光度法原理及應(yīng)用演示參考圖17

圖17（A）原位紫外-可見(jiàn)吸收光譜法測(cè)試電池裝置示意圖；（B）不同硫化物在電解液中的光學(xué)照片；（C）鋰硫電池放電時(shí)電壓-容量曲線圖；（D）不同硫化物在電解液中的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖；電極S-rGO（E）和電極S-GSH（F）在放電過(guò)程中的紫外-吸收光譜圖

實(shí)例：為了探究鋰硫電池在放電過(guò)程中巰基與硫共聚物的反應(yīng)機(jī)理，蘇州大學(xué)的Na Xu等人[5]利用原位紫外-可見(jiàn)吸收光譜法測(cè)試了鋰硫電池在第一次放電時(shí)硫化物成分的變化情況。圖17A為測(cè)試裝置示意圖。首先制備了L2S、Li2S2、Li2S3、Li2S4、Li2S6、Li2S8溶液（溶劑為電解液），通過(guò)紫外-吸收光譜法得到了對(duì)應(yīng)的吸收峰(圖17D)作為參考。測(cè)定電池在放電過(guò)程中的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，通過(guò)比對(duì)吸收峰的位置，確定了電極S-GSH（圖17F）在放電過(guò)程中并未有長(zhǎng)鏈多硫化鋰（Li2S6、Li2S8）的產(chǎn)生。

3.6 誤差分析：對(duì)朗伯-比耳定律的偏離

標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定未知溶液的濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線經(jīng)常發(fā)生彎曲，這種現(xiàn)象稱為對(duì)朗伯-比耳定律的偏離，如圖18所示。

紫外-可見(jiàn)分光光度法原理及應(yīng)用演示參考圖18

圖18 光度分析的工作曲線

主要原因是目前儀器不能提供真正的單色光，實(shí)際上儀器所提供的入射光是由波長(zhǎng)范圍較窄的光帶組成的復(fù)合光。由于物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光的吸收程度不同，因此引起了偏離。

為克服非單色光引起的偏離，首先應(yīng)選擇較好的單色器，此外還應(yīng)將入射波長(zhǎng)選定在待測(cè)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)且吸收曲線較平坦處。另外，當(dāng)溶液濃度較大時(shí)，吸光質(zhì)點(diǎn)可能發(fā)生締合等相互作用，影響對(duì)光的吸收。因此，朗伯-比耳定律只適用于稀溶液。

參考文獻(xiàn)

[1] Ali K, Dwivedi S, Azam A, et al. Aloe vera extract functionalized zinc oxide nanoparticles as nanoantibiotics against multi-drug resistant clinical bacterial isolates[J]. Journal of colloid and interface science, 2016, 472: 145-156.

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[3] 陳方正. 基于異靛藍(lán)的給體-受體型共軛聚合物及其有機(jī)薄膜晶體管器件[D].天津大學(xué),2018.

[4] 鄧菊慶,柏春玲,楊學(xué)芳,胡月新,吳怡.紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定不同品種柑橘皮中總黃酮含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2020,48(09):210-211+252.

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